樣品準(zhǔn)備（將五羥色胺轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>N-乙酰五羥色胺）是樣品的稀釋的一部分，將每一份樣品分別于酰化試劑一起溫育就可以得到酰化的五羥色胺。此實(shí)驗(yàn)采用的是競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的原理，生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到一定數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。zui后，結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量于樣品中被分析物的濃度成反比。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，洗板除去未結(jié)合的生物素標(biāo)記抗原，用抗生物素堿性磷酸酶做標(biāo)記、對(duì)硝基苯磷酸做底物來(lái)檢測(cè)結(jié)合到抗體上的生物素標(biāo)記抗原的量。用已知標(biāo)準(zhǔn)品做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣品的酶活性在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行定標(biāo)就可以得到未知樣品中五羥色胺的濃度。
| 注意 | 有些食物會(huì)含有一定量的五羥色胺，另外，有些藥物也會(huì)刺激五羥色胺的釋放，從而導(dǎo)致五羥色胺的濃度升高。病人應(yīng)當(dāng)禁食富含五羥色胺的食物，如：阿司匹林、促腎上腺皮質(zhì)激素、MAO抑制劑、phenazetin、兒茶酚氨、利血平和煙堿。 |
| 注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測(cè)時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性。不要使用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì)。 | ||||
| 貯存 | 18-25℃ | 2-8℃ | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。 |
| 穩(wěn)定性 | 2小時(shí) | 6小時(shí) | 3個(gè)月 | |
| 可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中。確定用于結(jié)果結(jié)算的總體積。使用前請(qǐng)將所有樣品混合并離心。 | ||
| 貯存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個(gè)月 | |
| 98%以上的循環(huán)五羥色胺都位于血小板內(nèi)，在血液凝集時(shí)就可以釋放出來(lái)。用靜脈穿刺的方法將全血收集到含EDTA或檸檬酸的塑料試管中（如10mlMonovette NC試管中加入1ml檸檬酸溶液）。 室溫下，將全血樣品以200×g的速率離心10分鐘得到富含血小板的血漿（PRP）。將PRP-上清轉(zhuǎn)移到另一試管中。 為了獲得血小板乳糜微粒，我們將200ulPRP（350000～500000個(gè)血小板/ul）加入到800ul生理鹽水中，之后4℃下以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）。離心后棄取上清。在血小板乳糜微粒中加入200ul雙蒸水，之后樣品就可以在-20℃以下的環(huán)境下凍存數(shù)周了。 將凍融的樣品在室溫下以1000×g的速率離心2分鐘。整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要使用20ul上清液（見(jiàn)酰化）。 如果您想測(cè)無(wú)血小板血漿（PFP）中五羥色胺的濃度，我們可以將PRP在4℃以4500×g的速率離心10分鐘（或4℃下10000×g的速率離心2分鐘）就可以獲得無(wú)血小板血漿（PFP）。游離五羥色胺的ELISA實(shí)驗(yàn)要使用50ul上清液（見(jiàn)酰化）。 注意：PRP中五羥色胺的直接檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明：大約10%的PRP樣品可以檢測(cè)到不可預(yù)知的高濃度五羥色胺（結(jié)果用液相層析和流氏細(xì)胞術(shù)獲得）。為了避免這種差異性，我們建議您即檢測(cè)血小板中五羥色胺，也檢測(cè)無(wú)血小板血漿中的五羥色胺。 | ||||
| | 無(wú)血小板血漿 | 血小板微粒（從血漿中分離得到） | 避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。 | |
| 儲(chǔ)存 | ≤-20℃ | ≤-20℃ | ≤-80℃ | |
| 穩(wěn)定性 | 2周 | 4周 | 1年 | |
| 使用組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般無(wú)特殊注意事項(xiàng) 注意：細(xì)胞培養(yǎng)基可能含有一定量的五羥色胺！ | ||
| 儲(chǔ)存 | ≤-20℃ | 避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融。 |
| 穩(wěn)定性 | 6個(gè)月 | |
| 注意 | 試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)所需的試劑成分。 |
| 數(shù)量 | 標(biāo)記 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。 |
| 1×5ml | ANTISERUM | 組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、 Tris緩沖液和0.01%的NaN3。 |
| 1×5ml | BIOTIN | 五羥色胺生物素，黃色，即用，內(nèi)含0.1%的NaN3。 |
| 1×0.2ml | ENZCONJ CONC | 酶聯(lián)物，10倍濃縮， 內(nèi)含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗生物素抗體、Tris緩沖液、HCl和0.01%的NaN3。 |
| 1×7×0.5ml | CAL A-G | 標(biāo)準(zhǔn)品A-G， 0;0.08;0.24;0.73;2.2;6.6;19.8ng/ml, 0;0.45;1.4; 4.1;12.5;37.4;112.3nmol/l, 即用，內(nèi)含酰化的五羥色胺、磷酸鹽緩沖液和0.1%的NaN3。 |
| 1×2×0.5ml | CONTROL 1+2 LYO | 質(zhì)控品1+2，凍干，內(nèi)含人血清和0.02%的NaN3。 具體濃度及可允許范圍請(qǐng)見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽。 |
| 1×3ml | ACYLREAG | 酰化試劑 內(nèi)含乙酸酐和丙酮，即用 |
| 1×50ml | ASSAYBUF CONC | 檢測(cè)緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、BSA和1%的NaN3。 |
| 1×50ml | WASHBUF CONC | 洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋內(nèi)，內(nèi)含對(duì)硝基苯酚磷酸鹽。 |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液，即用，內(nèi)含二乙醇胺、水和0.05%的NaN3。 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
2） 玻璃試管（12×75mm）
7） 帶儲(chǔ)器的8道移液器
10） 可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長(zhǎng)：600-650nm）
11） 雙蒸水或去離子水
12） 吸水紙、取樣吸頭和計(jì)時(shí)器
| 注意 | 用于96孔檢測(cè)的試劑成分可分成3次用。下述體積是使用4條（32孔）時(shí)所需要的體積。如果客戶想將標(biāo)準(zhǔn)品從7支減為6支的話，我們可以省掉標(biāo)準(zhǔn)品G。則檢測(cè)范圍相應(yīng)的減少到155ug/l（血漿）或706ug/l（血清，尿液，組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清）。 血清、尿液、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品可以選擇簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行，只需溫育3.5個(gè)小時(shí)（但血漿樣品不能采用簡(jiǎn)短操作步驟進(jìn)行），以上樣品也可以選擇可選操作步驟進(jìn)行檢測(cè)（將樣品溫育一整夜），血漿樣品必須按照溫育一整夜進(jìn)行檢測(cè)。 |
| 稀釋/溶解 | 成分 | 加入 | 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲(chǔ)存 | 穩(wěn)定性 |
| 15ml | 檢測(cè)緩沖液 | 150ml | 雙蒸水 | 1:10 | 出現(xiàn)黃褐色并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果 | 2-8℃ | 2周 |
| 15ml | 洗滌液 | 300ml | 雙蒸水 | 1:20 | | 2-8℃ | 4周 |
| | 質(zhì)控品 | 0.5ml | 雙蒸水 | | 靜置15min,混合時(shí)無(wú)泡沫 | ≤-20℃ | 有效期內(nèi)穩(wěn)定 |
| 60ul | 酶聯(lián)物 | 6ml | 稀釋的檢測(cè)緩沖液 | 1:101 | 臨時(shí)配置,只能使用一次 | 18-25℃ | 2小時(shí) |
| 3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底 物緩沖液 | | 臨時(shí)配置，只能使用一次 | 18-25℃ | 5小時(shí) |
| 注意 | 請(qǐng)不要酰化標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)酰化了。 樣品準(zhǔn)備可使血清、尿液、血小板乳糜微粒、組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清被稀釋107倍，而血漿樣品則被稀釋23.5倍。結(jié)果計(jì)算時(shí)必須將此稀釋因子考慮進(jìn)去。 |
| 1 | 將質(zhì)控品和樣品A分別20ul加入到玻璃試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
| 3 | 在每一試管中加入25ul酰化試劑1（3%），加入后立即旋渦混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入2ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合 |
| 6 | 1500×g下離心10分鐘 |
| 注意 | 準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。 |
| 1 | 將50ul樣品B加入到玻璃試管中。 |
| 2 | 在每一試管中加入100ul稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合。 |
| 3 | 在每一試管中加入25ul酰化試劑，加入后立即旋渦混合。 |
| 4 | 將試管蓋好，將試管放到37℃水浴箱內(nèi)溫育15分鐘。 |
| 5 | 在每一試管中加入1ml已稀釋好的檢測(cè)緩沖液，旋渦混合 |
| 6 | 1500×g下離心10分鐘 |
| 注意 | 準(zhǔn)備好的樣品必須立即檢測(cè)。其上清可在18-25℃下穩(wěn)定存放1小時(shí)。 |
| 1 | 將標(biāo)準(zhǔn)品、酰化好的質(zhì)控品和酰化好的樣品各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
| 4 | 蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育90min。 |
| 5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 6 | 在每一微孔中加入150ul臨時(shí)準(zhǔn)備好的酶聯(lián)物。 |
| 7 | 蓋板，室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
| 8 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 9 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
| 10 | 在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。 |
| 11 | 室溫（18-25℃）下振蕩（500rpm）溫育60min。 |
| 12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
| 13 | 加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。 |
| 1 | 將標(biāo)準(zhǔn)品、酰化好的質(zhì)控品和樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺生物素。 |
| 3 | 在每一微孔中加入50ul五羥色胺抗血清。 |
| 4 | 蓋板，輕輕振板，2-8℃下溫育16-20小時(shí)（一整夜）。 |
9.2.2第二天
| 1 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去參與液體。 |
| 2 | 在每一微孔中加入150ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。 |
| 3 | 蓋板，室溫振蕩器上（500rpm）溫育60分鐘。 |
| 4 | 移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板3次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
| 5 | 如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時(shí)，每孔間的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。 |
| 6 | 在每一微孔中加入200ul臨時(shí)配置好的PNPP底物液。 |
| 7 | 室溫振蕩器上（500rpm）溫育30分鐘。 |
| 8 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，振板以混合孔內(nèi)成分。 |
| 9 | 加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長(zhǎng)：600-650nm） |
將所有標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品的OD值減去空白孔的OD值。在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（Y軸，線性）對(duì)其濃度（X軸，對(duì)數(shù)）繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用自動(dòng)計(jì)算的方法繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Cubic spline、4參數(shù)或雙對(duì)數(shù)可以得到較好的曲線圖。在計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)當(dāng)應(yīng)用到每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)值（兩個(gè)數(shù)值中，明顯逸出的數(shù)值應(yīng)當(dāng)被忽略掉，采用更加合理的一個(gè)數(shù)值用）。樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上定量得到。
| 樣品 | 數(shù)量 | 單位 | 平均值 | 范圍 |
| 血清 | 99 | ng/ml | 88.6 | 30-200 |
| 無(wú)血小板血漿 | 35 | ng/ml | 3.7 | 1.8-7.5 |
| 血小板 | 35 | ng/109血小板 | 490 | 217-861 |
| 24小時(shí)尿液 | 49 | μg/d | 83.1 | ≤200 |
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