睪酮（TES）ELISA試劑盒

（德國DRG：EIA-1559）

1、前言

DRG公司的睪酮酶免試劑盒可用于人血清和血漿中睪酮的定量檢測。此試劑盒僅供體外診斷用。

睪酮（17β-羥基-4-雄烯-3-烷）是一種19C的類固醇激素，它在C-4和C-5間含一個不飽和鍵，C-3位置有一個酮基，C-17的β位上有一個羥基。此類固醇激素的分子量為288.47。睪酮是分泌到血液中zui主要的雄性激素。在男性中，睪酮主要由睪丸的間質細胞分泌；在女性中，處于循環中的睪酮50%來源于外周雄烯二酮的轉換，25%來源于卵巢，25%來源于腎上腺。睪酮負責男性第二性征的形成，檢測睪酮濃度有助于評價性腺機能減退的狀態。在女性中，在很多疾病中睪酮的濃度都很高，如：多毛癥，女子男性化，多囊卵巢癥，卵巢癌，腎上腺癌和腎上腺增生。而在男性中，高水平的睪酮通常與下丘腦垂體疾病、睪丸癌、先天性腎上腺增生和前列腺癌有關。在患下列疾病的病人體內，通常可發現睪酮水平很低：垂體機能減退癥、克氏綜合征、睪丸女性化綜合征、睪丸切除術、隱睪病、酶缺陷和一些自身免疫疾病。

2、實驗原理

   DRG公司的睪酮酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應板上的微檢測孔包被有能結合睪酮分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內源性睪酮的病人樣本與辣根過氧酶標記的睪酮競爭性的結合包被板上的抗體。溫育之后，未結合的酶聯物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結合量與樣品中睪酮的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中睪酮的濃度成反比。

3、試劑盒成份

1）      預包被反應板，12×8孔，包被板上包被了單克隆的鼠抗睪酮抗體。

2）      標準品系列，共7支，1.0 ml/支，濃度：0；0.2；0.5；1；2；6；16ng/ml。

轉換系數：1ng/ml=3.467nmol/l。

3）      酶聯結物，1支，25ml，內含辣根過氧酶標記的睪酮。

4）      底物/顯色劑，1支，25ml，內含TMB。

5）      終止液，1支，0.5M的H₂SO₄ ，14ml，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

6）      濃縮洗滌液（40X），1支，30ml。

注意：用于樣品稀釋的零標準品因視需要而定。

4、實驗所需材料（但試劑盒不提供）

1）標準移液器   2）酶標儀

3）吸水紙         4）蒸餾水

5、試劑盒的儲存與穩定性

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存時，其活性在有效期內穩定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲存于2-8℃的環境下，微孔反應板也必須貯存于2—8℃的環境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。

6、試劑準備

洗滌液的準備

 吸取40×濃度的洗滌液30mL用1170mL的蒸餾水混合定容至1200mL，稀釋好的洗滌液在室溫能保存2周

7、樣品

在此實驗中將用到血清或血漿（EDTA-，肝素-或檸檬酸血漿），不要使用溶血、黃疸血或脂血樣品。

請注意：含有*的樣本不能使用

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，室溫下離心獲取血清。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲存

實驗開始前，應當將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環境下可穩定存放5天。如果實驗前想要將樣品存放更長的時間，則應將樣品凍存于-20℃的環境下。解凍的樣品在實驗前應反復倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在實驗時，如果血清樣品中睪酮的濃度高于zui高標準品中睪酮的濃度，則應將此樣品用零標準品稀釋10或100倍，并按實驗步驟重新檢測。在計算濃度時應當將此稀釋因子考慮進去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標準品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標準品（充分混合）

8、一般注意事項

1）      所有試劑和樣本在使用之前必須平衡至室溫。所有試劑必須搖勻但不能起泡沫。

2）      一旦檢測開始，所有的操作步驟必須進行到底不能中斷。

3）      為了避免交叉放映，每一標準品、質控品和樣品的取樣都必須使用新的取樣吸頭。

4）      吸光度值是由孵育的時間和溫度所決定的。在實驗開始之前，建議準備好所有的藥劑旋開蓋子。

5）      將所需檢測的微孔板條固定在板架上等。這些準備工作將確保每次的加液步驟所需時間相同，沒有中斷。按一般的規律，酶免反應的強度與時間和溫度成線性比例。

9、實驗步驟：

1）      將所需數量的板條固定到板架上。

2）      將標準品、質控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應的微孔中。

3）      在每一微孔中加入200μL酶聯物。

4）      充分混勻10秒，在這個步驟*混勻很重要。

5）      室溫孵育60分種。

6）      快速棄取孔內反應物，每孔用400μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度。

7）      在每一微孔中加入200μl底物液。

8）      室溫孵育15分種。

9）      加100μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應。

10）  加終止液后10分鐘之內，用酶標儀在450±10nm處測定OD 值。

10、結果計算

1）      計算每個標準品、質控品和病人樣本的平均吸光度值。

2）      用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應的濃度值進行標繪，作一條標準曲線。

3）      用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應的濃度。

4）      自動計算方法：在IFU上，它用四參數曲線已自動計算出結果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結果。

5）      樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應當把此稀釋因子考慮進去。

11、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。在一次明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的睪酮ELISA試劑盒進行檢測得到如下結果：

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

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